摘要:体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术。重组酶介导的扩增(recombinase-aid amplification,RAA)技术是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。RAA 法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶代替了传统PCR 的热循环解链过程, 实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增,有望在不远的将来取代传统的热循环PCR 反应。

Abstract: Nucleic acid amplification is a biotechnology that trace nucleic acid can be rapidly amplified in vitro. Recombinase-aid amplification (RAA) is the  most recent isothermal amplification technology, in which the classical thermal  stable enzyme has been replaced by recombinase,single-stranded DNA binding (SSB) and DNA polymerase. Therefore, the RAA reaction can be carried out at optimized37°C or under the room temperatures without any heating assistance. These merits could largely facilitate RAA more applicable than PCR in the near future.

关键词:重组酶  体外核酸扩增

 

在过去10年中,若干恒温核酸扩增技术得到快速发展[1],如SDA技术、TMA技术、HDA技术、LAMP技术和RPA/RAA技术等。本文介绍的 重组酶介导扩增 (recombinase-aid amplification,RAA)技术是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。 与RPA 不同的是, RAA 扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶[2]。在37℃恒温下, 该重组酶可与引物DNA 紧密结合, 形成酶和引物的聚合体,当引物在模板DNA 上搜索到与之完全互补的序列时,在单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNA binding, SSB)的帮助下,使模板DNA 解链,并在DNA 聚合酶的作用下,形成新的DNA 互补链。反应产物也是以指数级增长,通常在1 h 内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段[3],整个反应简单快速,因为不需要高温循环,所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。

 

1. 材料与方法

1.1 蛋白与DNA 

天蓝色链霉菌重组酶蛋白(SC-recA)和枯草芽孢杆菌重组酶蛋(BS-recA)分别来自天蓝色链霉菌和枯草芽孢杆菌.将天蓝色链霉菌、枯草芽孢杆菌重组酶基因分别克隆至pET21a表达载体中,过量表达后用Ni-NTA 亲和层析纯化,并用Bradfo-rd 法定量。重组DNA 是rnd 基因编码区的一部分(310 bp),将此片段连接到载体上, 转化大肠杆菌获得含重组DNA 的菌株(Top10)。


1.2 RAA 扩增

将含有目的片段的大肠杆菌Top10 菌株过夜培养,从中取出1 mL 菌液,100℃加热10 min。冷却至室温,从中取出1 μL 作为扩增模板。引物A、B 大小分别为34 和32 nt。反应体系如下:50 pmol 引物A;50pmol 引物B; 1 mmol/L dNTP; 90 ng/μL SSB 蛋白; 120ng/μL recA 重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA);30 ng/μL Bsu DNA 聚合酶;反应缓冲液(100 mmol/L Tricine,pH 8.0;100 mmol/L 醋酸镁;5mmol/L 二硫苏糖醇; 5%PEG 20K;2.5 mmol/L ATP;100 ng/μL 肌酸激酶)。摇匀后放置于37℃培养箱温浴1 h。 取10 μL 反应产物经酚/氯仿提纯后, 在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。

 

2. 结果与分析

在细菌或真菌DNA 复制过程中,重组酶蛋白起着重要的作用。重组酶蛋白可与单链DNA 结合而阻止细胞核内核酸酶对单链DNA的降解,在DNA重组过程中, 重组酶还负责基本的碱基配对[4]。当然,在体内,还会有其他辅助性蛋白,如recB,recC 和单链DNA 结合蛋白等,共同参与到DNA 的重组中。因此,在进行核酸体外扩增时,重组酶蛋白无疑是起着决定性作用的反应催化剂。为了验证重组酶的作用,设计了有针对性的RAA 扩增体系,除了SC-recA、BSrecA重组酶外,还加入了DNA 聚合酶和辅助蛋白Bsu 等。

实验结果表明,在目前的反应体系中,含有SC-recA 和BS-recA 重组酶的反应体系都可以正确扩增出目的片段,说明SC-recA 和BS-recA 重组酶均具有催化功能,而且反应的特异性很高。扩增的目的片段长310 bp,是之前克隆到载体里的rnd 基因编码区的一部分。

 

3. 结论

3.1 重组酶蛋白在RAA 反应中的作用

重组酶都能够与DNA 紧密结合,这是使核酸体外扩增反应顺利进行的关键一步。在体外核酸扩增体系中,重组酶蛋白的作用是帮助DNA 模板的解链和促使模板与引物之间发生链替换,随后在DNA 聚合酶的催化下,扩增出新的DNA 片段[5]。这一替换过程需要ATP 来提供能量,然后在单链结合蛋白的辅助下,Bsu DNA 聚合酶可以对链替换后的目的DNA 进行特异地延伸。由于ATP 在CK激酶催化下可以利用磷酸肌酸(phosphocreatine)实现再生,使这一反应过程中的化学平衡倾向于产物的合成,并且这一过程可以被不断地重复,从而最终实现核酸的高效扩增。


3.2 重组酶介导扩增法反应的建立和优化。

在RAA 反应中,酶无疑是最重要的成分,酶的纯度直接决定了反应能否顺利进行,因为反应仅在37℃下进行,任何不必要的杂质都会影响到反应的结果,特别是核酸酶的污染,而核酸酶在传统的高温PCR 中几乎可以被忽略。因此,在进行酶的纯化时,特别强调核酸酶的去除,以及保持酶的活性。通过Ni-NTA 亲和层析(Ni-NTA agarose)可以去掉大部分杂质,获得高纯度的酶.每个反应中酶的定量也很重要,除了重组酶,还有3~4 个酶参与扩增反应,它们之间需要合理的比例,才能够得到预期的扩增结果。  

RAA常温核酸扩增法对模板是不挑剔的,可以是质粒DNA,也可以是含有质粒的菌液,动植物DNA均可以作为模板。甚至可以使用RNA 直接作为模板,而无需额外的逆转录过程。RAA法扩增对核酸中的GC含量也不受限制,所以能有效解决许多疑难PCR的问题并且非常适合用于全基因组扩增。

RAA方法中引物与模板严格互补的特点,使其可以用于SNP 和甲基化的检测,只要与引物配对的模板DNA上有一个碱基的差异,就可以用RAA 方法检测出来。


3.3 RAA 常温扩增的应用前景

RAA技术的优势使其有望在很大程度上代替传统的PCR技术。由于传统的PCR技术受仪器和空间的限制,使得现有核酸扩增技术的应用价值没有被充分挖掘出来。RAA技术不依赖于PCR仪器的便捷性能,是革命性的技术突破,能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。此外,RAA技术还能完成多重引物扩增,配合荧光仪,可形成一套RAA多重荧光实时检测系统,即利用不同颜色的荧光标记,在同一个反应里检测到不同的目的基因,这是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的特点。

随着RAA技术的进一步深化、完善,在RAA技术的基础上可以很快地研发出适合家庭使用的分子诊断试剂,使全国乃至全球对病毒性和遗传性疾病的定期和快速普查在技术上成为可能。这将是一个非常巨大的潜在市场,其经济意义不可估量。结合其他优秀技术,如发展免疫RAA,可使检测对象从核酸扩大到蛋白质、糖类或其他大分子化合物。同时,RAA技术也可作为一种基础的研究手段,进一步促进分子生物学的研究。RAA技术极有可能帮助功能基因组学和植物分子生物学获得突破性进展,进而形成更加巨大的生物科技产业。

 

 

【参考文献】

[1] Gill p, Ghaemi A, Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review. Nulcleosides, nucleotides& nucleic acids, 2008, 27:224-243

[2] 彭涛. 核酸等温扩增技术及其应用. 北京: 科学出版社, 2009. 98

[3] 吕蓓,程海荣,严庆丰,等.用重组酶介导扩增技术快速扩增核酸.中国科学:生命科学,2010,40(10):983-988.

[4] Kuzminov A. DNA replication meets genetic exchange: cromosomal damage and its repair by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 8461—8468

[5] 吕蓓,张志芳等  体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新。中国生物工程杂志, 2011,31(3):91-96 

2017年09月11日

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文献︱用重组酶介导扩增技术快速扩增核酸

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